CROMATOGRAFIA IN STRAT SUBTIRE - Analiza cantitativa a unui amestec de indicatori

CROMATOGRAFIA IN STRAT SUBTIRE

Analiza cantitativa a unui amestec de indicatori

Faza stationara: Kieselgel 60 (Merck, Germania), 10 x 10 cm pe suport de sticla

Faza mobila: toluen p.a., (Merck, Germania)

Solutii standard: amestec de concentratie cunoscuta de indicatori (concentratie 100; 200; 300; 400 si 500 mg/mL) - timol-indofenol, rosu de Sudan III, albastru de Sudan II, galben de dimetil dizolvati in etanol (Figura 1)

Solutia proba: amestec de indicatori in etanol cu concentratie necunoscuta

Aplicarea probelor: in spoturi, manual;

aplicarea de volume egale (20 mL) din solutiile standard de indicatori cu ajutorul unor capilare calibrate

aplicarea de 20 mL solutie proba de concentratie necunoscuta

Camera cromatografica: standard (Desaga, Germania) pentru placi cromatografice de dimensiunea de 10 x 10 cm, saturata anterior cu vaporii eluentului

Developare: developare ascendenta pe o distanta de 8 cm de la linia de start (Figura 2)

Uscarea placilor: in curent de aer cald SUB NISA!

Evaluarea calitativa si cantitativa: fara derivatizarea placii; cu ajutorul unui scanner controlat de calculator si prelucrarea digitala a imaginii cromatogramei cu ajutorul programului UN-SCAN-IT gel v. 6.1 (Silk Scientific Inc., SUA)

Figura . Structurile chimice ale indicatorilor separati prin cromatografie in strat subtire

Figura . Placa cromatografica obtinuta in urma separarii unui amestec de indicatori; TI - timol-indofenol, RSG - rosu de Sudan III, ASII - albastru de Sudan II, GD - galben de dimetil

Std1 mL solutie 100 mg/mL TI, RSG, ASII si GD in etanol

Std2 mL solutie 200 mg/mL TI, RSG, ASII si GD in etanol

Std3 mL solutie 300 mg/mL TI, RSG, ASII si GD in etanol

Std4 mL solutie 400 mg/mL TI, RSG, ASII si GD in etanol

Std5 mL solutie 500 mg/mL TI, RSG, ASII si GD in etanol

Proba mL solutie cu concentratie necunoscuta de TI, RSG, ASII si GD in etanol

MOD DE LUCRU

Dupa separarea cromatografica a amestecului de indicatori, placa cromatografica este scanata la rezolutie de 300 dpi cu ajutorul unui scanner CANON 3000F. Imaginea obtinuta este salvata sub forma unui fisier imagine de tip JPG si se va prelucra cu ajutorul programului UN-SCAN-IT gel v. 6.1 in vederea integrarii spoturilor cromatografice prin insumarea numarului de pixeli corespunzator fiecarui spot (Image Profile Extraction). Pentru realizarea curbelor de calibrare si in vederea evaluarii cantitative rezultatele integrarii vor fi prelucrate cu ajutorul programului Microsoft Excel.

A.    Prelucrarea imaginii scanate a placii cromatografice cu programul UN-SCAN-IT gel

1. Dupa demararea programului UN-SCAN-IT gel si selectarea optiunii "Digitize a Gel" se alege imaginea scanata si salvata a placii cromatografice.
2. Din fereastra aparuta se alege modul de analiza a benzilor pozitive ("Lane analysis/Positive") si se apasa pe butonul OK.
3. Pentru transformarea imaginii color in format alb-negru se apasa butonul "Yes" in fereastra aparuta.
4. Fereastra aparuta permite setarea parametrilor de integrare a spoturilor cromatografice pastrand optiunile implicite propuse (Figura 3):

Figura . Setarea parametrilor de integrare

Color Mode: Grayscale Intensity

Background Correction: Standard Mode - Density Profile Extraction

Optical Density Calculation: Linear - Standard Reflective Scan

Scan Direction: Bottom to Top

Lane Drawing Method: Standard Drawing Mode

Lane Width: Variable

Saturation Checking: On

ACGT Sequence Mode: Off

5. Cu ajutorul butonului stanga al mouse-ului se definesc toate benzile cromatografice luate in lucru astfel incat sa cuprinda in intregime toate spoturile scromatografice obtinute (Figura 4). Dupa definirea primei benzi cu o latime suficient de mare pentru a cuprinde in latime oricare spot de pe placa cromatografica, zona definita poate fi copiata de mai multe ori prin apasarea butonului "Copy". Noul camp aparut se muta deasupra urmatoarei benzi cromatografice astfel incat sa cuprinda in latime toate spoturile benzii respective. Dupa definirea campurilor tuturor benzilor cromatografice acestea vor fi aliniate selectand optiunea Options/Align Lanes/Bottom validand valoarea propusa in fereastra aparuta prin apasarea butonului OK.

Figura . Definirea spatiilor corespunzatoare benzilor cromatografice

6. Pentru integrarea spoturilor cromatografice ale benzilor definite anterior, se apasa butonul "Digitize" din dreapta jos.
7. In fereastra urmatoare se afiseaza cromatograma primei benzi a placii cromatografice, unde se integreaza picurile cromatografice corespunzatoare rosu de Sudan III (RSG) si galbenului de dimetil (GD) standard si a celor din proba necunoscuta. Limitele integrarii spoturilor oferite automat de program se pot modifica cu ajutorul mouse-ului. Limitele picurilor se aleg si cu ajutorul ferestrei de vizualizare a benzii cromatografice din partea dreapta a ecranului. Cu ajutorul butoanelor "+ Add peak" sau "- Del Peak" se pot sterge sau adauga picuri noi.

Chiar daca nu s-a obtinut o separare completa intre spoturile cromatografice baza picurilor se alege a fi linia corespunzatoare valorii 0 a intensitatii semnalului.

(Figura 5).

Figura . Integrarea picurilor cromatografice

8. Dupa integrarea picurilor RSG si GD ale primei benzi cromatografice se apasa butonul "Quantify Peaks" din stanga jos a imaginii (Figura 6). Prin apasarea butonului "Continue" se trece la integrarea benzii urmatoare.

Figura . Afisarea picurilor integrate

9. La sfarsitul integrarii picurilor fiecarei benzi se va afisa din nou imaginea placii cromatografice. Are loc vizualizarea centrului si limitelor fiecarui spot alaturi de un cod din cifre alocat pentru identificarea acestora. Rezultatele integrarii sunt afisate in tabelul de la baza ecranului (Figura 7).

Figura . Vizualizarea spoturilor integrate si a rezultatelor integrarii

10. Pentru transferarea rezultatelor integrarii in programul Microsoft Excel in vederea determinarilor cantitative se apasa pe butonul "Save Data to Clipboard", iar in fereastra aparuta se alege aria picurilor ("Pixel Total") si pozitia centrului spotului cromatografic ("Y Position"). Procedura este validata prin apasarea butonului OK.
11. Se selecteaza cele trei coloane ale tabelului aparut si se apasa butonul"Copy".
12. Datele stocate in memoria tampon a calculatorului se copiaza intr-o foaie de calcul a unui fisier Microsoft Excel prin combinatia de taste Ctrl-V. (Tabel 1)
13. Pentru a termina programul UN-SCAN-IT gel se apasa pe butonul "Exit Digitizing" din coltul dreapta jos al ecranului.

B.    Realizarea curbelor de calibrare si calculul concentratiilor necunoscute de albastru de Sudan II si galben de dimetil cu ajutorul programului Microsoft Excel

1. Se reprezinta ariile picurilor in functie de cantitatea de substanta aplicata pe spot si se realizeaza o corelare liniara intre punctele obtinute (Figura 8).
2. Cu ajutorul pantei si interceptului curbelor de calibrare se calculeaza cantitatea necunoscuta de indicator din spotul probei necunoscute.
3. Cunoscand cantitatea de indicator din spotul probei necunoscute si volumul de proba aplicat pe placa cromatografica se calculeaza concentratia in rosu de Sudan III si galben de dimetil din proba analizata.

EXEMPLU CALCUL

Tabel 1. Rezultatele integrarii pentru solutiile standard si solutia proba de indicatori (ASII si GD)

Figura . Dreptele de calibrare obtinute pentru standardele de Rosu de Sudan III si Galben de dimetil

Tabel 2. Calculul cantitatii necunoscute de Rosu de Sudan III si Galben de dimetil cu ajutorul parametrilor dreptelor de calibrare (panta si intercept)